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由于WB實驗實驗流程長、涉及步驟多、操作細(xì)節(jié)要求高，經(jīng)常會出現(xiàn)一些NG的情況讓W(xué)B新手摸不著頭腦。為了幫助大家更好地完成WB實驗，我們給大家整理了一些WB中常見的問題，并讓技術(shù)老師給參考處理辦法，幫助大家解決實驗問題，實驗順順順！

1.“微笑”條帶

原因：凝膠不充分；電壓過高；溫度過高；電泳速度過快

建議：待充分凝膠后再電泳；降低電壓；低溫電泳；減慢電泳速度

2.“皺眉”條帶

原因：凝膠與玻璃擋板質(zhì)之間有氣泡

建議：在兩板間加入適量緩沖液以排除氣泡

3.條帶拖尾

原因：凝膠濃度過高；電泳緩沖液失效；蛋白降解

建議：重新配制電泳緩沖液；降低凝膠濃度；

4.垂直紋理

原因：樣品裂解不充分；樣品有不溶性顆粒；蛋白降解

建議：加樣前離心樣品；優(yōu)化蛋白提取方法，尋找合適裂解液

5.條帶模糊

原因：蛋白未完全變性；電泳太快；轉(zhuǎn)膜問題

建議：完全變性蛋白樣品、降低電泳時間、電泳之后及時將凝膠浸泡在轉(zhuǎn)膜液中

6.膜上無大分子條帶

原因：轉(zhuǎn)膜時間短；蛋白太大轉(zhuǎn)不過

建議：轉(zhuǎn)膜條件（延長時間）、選擇濕轉(zhuǎn)（半干轉(zhuǎn)不適合大分子條帶）、選擇NC膜，降低凝膠濃度

7.膜上無小分子條帶

原因：膜孔徑大于蛋白，轉(zhuǎn)膜時間過長

建議：減少轉(zhuǎn)膜時間，選擇PVDF膜

8.膜上無條帶

原因：操作原因；膜的選擇不適合，蛋白與膜的結(jié)合能力弱

建議：檢查轉(zhuǎn)膜條件、選取合適的膜

9.蛋白條帶轉(zhuǎn)到濾紙上

原因：電壓過高；時間過長；膜的孔徑太大

建議：降低電壓，減少轉(zhuǎn)膜時間；選擇合適的膜

信號強(qiáng)度低是指在正常曝光條件下得到的目的條帶微小或是沒有目的條帶，而增加曝光時間又會招致背景高、雜帶多等問題。掃除試劑質(zhì)量、操作失誤等方面的影響，這一類問題產(chǎn)生的主要緣由如下：

10.樣本蛋白表達(dá)量缺乏

倡議添加蛋白表達(dá)量較高的細(xì)胞系作為陽性對照，或是恰當(dāng)增加上樣量以取得較高程度的信號；

11.蛋白質(zhì)降解

在蛋白樣品制備期間留意蛋白酶抑止劑 PMSF 的運(yùn)用，所制備的樣品盡快檢測或妥善保管；

12.蛋白的轉(zhuǎn)膜

運(yùn)用恰當(dāng)孔徑的膜，同時優(yōu)化轉(zhuǎn)膜時間，關(guān)于高分子量蛋白可能需求更長的轉(zhuǎn)膜時間；

13.抗體的運(yùn)用

確保抗體的反應(yīng)種屬與實驗類型需求可以滿足實驗的需求，此外，抗體的稀釋比、孵育時間等問題也需求在實驗中不時優(yōu)化；

14.蛋白與抗體分離率低

減少洗膜次數(shù)或縮短洗膜時間，降低洗膜液中 NaCl 濃度等；

15.抗原被封鎖液遮蓋

換用不同的封鎖液，優(yōu)化封鎖液中蛋白質(zhì)濃度并縮短封鎖時間；

16.甲醇濃度過高

會招致蛋白質(zhì)與 SDS 別離，并沉淀在凝膠中，同時使凝膠收縮或變硬，從而抑止高分子量蛋白的轉(zhuǎn)移。實驗中可恰當(dāng)降低甲醇濃度或者運(yùn)用乙醇、異丙醇替代。

WB 結(jié)果中目的條帶之外的條帶被稱為非特異性條帶，有時非特異性條帶很明顯，卻沒有目的條帶，這些狀況對結(jié)果剖析會產(chǎn)生很大的干擾。一般來說，引起這類問題的主要要素有：

17.抗體的非特異性分離

通常以為，多抗的特異性不如單抗，更容易產(chǎn)生非特異性條帶，而恰當(dāng)降低抗體的濃度有助于減少雜帶。同時為了掃除二抗非特異性分離的可能，倡議設(shè)二抗陰性對照；

18.樣品蛋白量過高

恰當(dāng)降低上樣量，同時延長洗濯時間與封鎖時間可防止蛋白量過高對實驗結(jié)果的不良影響；

19.蛋白質(zhì)降解

會招致條帶位置變化并產(chǎn)生更多雜帶，倡議采用新穎制備的或是凍融次數(shù)較少的樣品；

20.細(xì)胞傳代次數(shù)過多

會招致蛋白表達(dá)形式的分化，倡議運(yùn)用原始或傳代少的細(xì)胞株；

21.蛋白存在復(fù)合物

有的目的蛋白會和其他蛋白分離構(gòu)成復(fù)合物，招致條帶位置改動，需求查閱相關(guān)文獻(xiàn)來肯定蛋白能否會構(gòu)成穩(wěn)定復(fù)合物；

22.蛋白存在剪接體或多種修飾方式

局部蛋白存在剪切位點，有的剪切體具有免疫活性，在 WB 中也會被檢測出。此外有的目的蛋白會存在糖基化位點或其他修飾位點，條帶大小可能會遠(yuǎn)超理論分子量。因而需求查閱文獻(xiàn)或是 uniprot 來得知蛋白的剪切體大小以及修飾位點等。

在局部 WB 結(jié)果中，條帶之外本應(yīng)是空白的背景也會有較深的顏色，對剖析結(jié)果會產(chǎn)生干擾，而且結(jié)果圖不美觀，難以用于文章發(fā)表。這種問題的可能緣由有以下幾點：

23.封鎖不充沛

背景過高的主要緣由之一是封鎖有問題，倡議運(yùn)用適宜的封鎖劑（脫脂奶粉、BSA 等），優(yōu)化反響濃度與封鎖時間，同時留意防止呈現(xiàn)抗體與封鎖劑的穿插反響，以及封鎖劑與含有目的抗原，內(nèi)源性生物素或者與抗生物素蛋白/鏈霉親和素不相溶等問題；

24.洗膜不充沛

恰當(dāng)增加洗膜次數(shù)弛緩沖液體積，進(jìn)步吐溫20的百分比可改善由洗膜不充沛招致的背景高的問題；

25.抗體的運(yùn)用

一抗?jié)舛蛇^高是高背景的緣由之一，且二抗也存在與封鎖劑非特異性分離的可能，因而倡議恰當(dāng)優(yōu)化一抗?jié)舛?，并設(shè)二抗陰性對照；

26.曝光時間長

倡議在實驗中采用適宜的曝光時間。

有時 WB 結(jié)果圖中條帶位置契合預(yù)期，但卻由于條帶彌散、外形怪異等要素招致無法運(yùn)用，呈現(xiàn)這種狀況多半是制膠或電泳過程出了問題，詳細(xì)如下：

27.電泳時電壓、電流過高

會招致條帶遷移速率過快以及 SDS-PAGE 溫度升高，并可能使得條帶彌散、外形變形。倡議運(yùn)用適宜的電泳條件并堅持低溫；

28.電極不均衡

會招致條帶偏斜，上樣時在無樣品的膠孔中參加等量樣品緩沖液可防止這種狀況；

29.上樣量過高，樣品中鹽離子濃度較大

上樣量過高可能會招致條帶彌散，樣品中的鹽離子濃度不分歧則會招致條帶不齊等問題。因而在上樣時需保證樣品量分歧且恰當(dāng)，并堅持相同的、較低的鹽離子濃度；

30.制膠問題

在配膠時一定要保證充沛混勻，平均凝膠，上樣前用針頭將膠孔撥正并吹出膠孔中的氣泡。

31.電泳緩沖液寄存過久

電泳實驗中的緩沖液假如放置過久也會對結(jié)果有不良影響，因而倡議及時改換新的緩沖液。

有時在 WB 做出結(jié)果后，除了目的條帶以外，膜上還散布著不規(guī)律的污點，對結(jié)果也會有較大的干擾。這類問題產(chǎn)生的主要緣由有以下幾點：

32.試劑、儀器等污染

倡議在每次實驗前后留意清算實驗儀器，同時及時改換呈現(xiàn)問題的試劑；

33.轉(zhuǎn)膜時有氣泡

確保在轉(zhuǎn)膜過程中將氣泡掃除潔凈；

34.抗體孵育時與膜接觸不充沛

確保在抗體孵育過程中，液體總量足夠，同時將抗體平均配置，并在搖擺的條件下停止孵育；

35.曝光時間

過度曝光會招致斑點更明顯，倡議采用適宜的曝光時間；

36.膜枯燥

實驗中要保證有充沛的反響液，防止呈現(xiàn)干膜現(xiàn)象。